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美国红鱼海豚链球菌分离、鉴定、致病性及检测技术研究论文
2022-01-31 05:46    来源: 未知      点击:

  (细胞生物学专业优秀论文)美国红鱼海豚链球菌分离、鉴定、致病性及检测技术研究

  内容提示:致谢四年的学习生涯即将结束, 在这四年中既有自己奋斗的汗水, 更有老师、 朋友、 家人和同事的帮助和理解, 是他们的鼓励和支持让我克服艰难困苦, 执着地坚持。首先要衷心感谢导师邵健忠教授, 不仅在学习、 实验和工作上给予我悉心指导和热情帮助, 更以耐心细致的谆谆教诲、 严谨求实的治学风格、 正直坦率和处处替他人着想的为人处世, 深深地感动了我,教育了我。 同时, 我也要感谢项黎新副教授对我热情的关心、 帮助和支持。其次要感谢浙江省淡水水产研究所钱冬研究员在实验、 资料查阅中给予的大力帮助, 感谢刘问助理研究员在实验过程中给予的热情帮助, 感谢沈...

  致谢四年的学习生涯即将结束, 在这四年中既有自己奋斗的汗水, 更有老师、 朋友、 家人和同事的帮助和理解, 是他们的鼓励和支持让我克服艰难困苦, 执着地坚持。首先要衷心感谢导师邵健忠教授, 不仅在学习、 实验和工作上给予我悉心指导和热情帮助, 更以耐心细致的谆谆教诲、 严谨求实的治学风格、 正直坦率和处处替他人着想的为人处世, 深深地感动了我,教育了我。 同时, 我也要感谢项黎新副教授对我热情的关心、 帮助和支持。其次要感谢浙江省淡水水产研究所钱冬研究员在实验、 资料查阅中给予的大力帮助, 感谢刘问助理研究员在实验过程中给予的热情帮助, 感谢沈锦玉研究员、 黄惟灏高级工程师、 尹文林工程师、 吴颖蕾助理工程师的关心和帮助, 感谢浙江省海洋水产研究所许文军工程师、 张学舒高级工程师、 楼宝工程师、 史海东工程师, 西闪试验场许源剑场长等在试验中给予的热情帮助。也要感谢我的家人, 特别是我的儿子朱海尔。 感谢他们在我攻读硕士期间对我的理解、 付出和支持, 以及始终给予我的精神鼓励。最后, 对所有关心、 帮助过我的人表示衷心的感谢!沈智华20 0 5年5月 摘要美国红鱼( & b ia en o p so cel]a tu s), 又名眼斑拟石首鱼, 属鲈形目石首鱼科,原产于北大西洋沿岸及墨西哥湾, 因其肉质细嫩、 生长快、 广温、 广盐等优点,而成为迄今世界上养殖产量最高的鱼种之一。 我国于19 9 1年引进, 19 9 5年繁殖成功, 现已在沿海各地网箱和池塘中广泛养殖。 随着养殖规模的扩大和放养密度的提高, 美国红鱼的病害发生日趋频繁。从20 0 0 年下半年开始, 浙江省舟山部分网箱养殖美国红鱼发生不明病因的死鱼, 在此后的一年多时间里, 陆续有死鱼发生, 造成较大损失。 20 0 1年12月赴该养殖场进行病原分离, 观察到发病鱼表现为眼球突出、 浑浊, 皮肤溃疡等症状, 从患病鱼中分离到sO 一2和S 0- 3两株菌, 并对分离菌株进行了形态观察、 生理生化性状测定、 16 S r R N A 基因P C R 鉴定。 实验结果表明, 两菌株具有典型的海豚链球菌特性: 在显微镜下为球形细胞, 呈长短不一的链状排列, 革兰氏染色阳性: 在血琼脂平板上显示13溶血: IO 。 C 生长, 4 5℃不生长; 接触酶阴性; 水解七叶苷、 精氨酸, V P 试验、 脲酶和马脲酸试验阴性; 发酵葡萄糖、 水杨苷、 蔗糖和淀粉, 不发酵阿拉伯糖、 菊糖、 乳糖、 蜜二糖、 棉子糖和山梨醇等。 用海豚链球菌种特异引物进行16 S r R N A 基因特异性扩增法得到预期的30 0 b p 的产物。 根据以上实验结果。 结合《伯杰氏系统细菌学手册》 及国外鱼类海豚链球菌疾病的报道, 确定该两株菌为海豚链球菌( S tr ep to co ccu s inia e)。对sO ~2和S O 一3进行了回归感染试验、 罗a # 鱼和小白鼠致病性试验, 结果表明: 两株海豚链球菌对美国红鱼、 罗非鱼及小自鼠均有致病力。 sO 一2和S O 一3对美国红鱼的L D 。 。 分别为4. 8× 108C F U /m L 和1, 9× 107 C F U /m L , 对罗非鱼的L D ; 。 分别为2. 8× 108C F U /m L 和8. 3× 10C F U /m L , 对小白鼠的L D 。 。 分别为9 . 6× 106C F U /m L和4 , 2× 1矿C F U /jT lL 。 试验感染鱼可出现眼球突出、 浑浊及失去方向性等与自然发病鱼相似的症状, 因此确认此两株海豚链球菌为引起美国红鱼死亡的病原菌。sO 一2和S O 一3对小鼠的毒性分别为对美国红鱼毒性的50 倍和4 . 5倍及对罗非鱼的29 2倍和19 . 8 倍。 从中可以看出, 该两株菌对哺乳动物小鼠具有比对原宿主美国红鱼更强的致病性, 这与国外报道的海豚链球菌对小鼠具致病性并可引起人 类侵袭性疾病的结论相符。 海豚链球菌引起的鱼类疾病, 不仅对渔业生产造成危害, 而且对食品安全和人类健康构成了威胁。对sO 一2和so 一3进行了药物敏感性试验。 结果表明: 两菌株对氨卞青霉素、万古霉素和先锋V 等高度敏感, 对庆大霉素、 复方新诺明、 林可霉素、 氟哌酸等不敏感。初步建立了海豚链球菌检测方法。 制备了S 0 2 和S O3两菌株的小鼠血清和腹水抗体。 用微孔板菌体凝集反应测得两株菌血清型相同, 血清抗体效价为1: 16~l: 256, 腹水抗体效价为1: 8 ~l: 64 。 用间接E I。 IS A 法测得血清和腹水抗体效价分别为l: 64 0 0 和1: 320 0 。 用D o tE I。 IS A 法检测海豚链球菌, 最低检出量为1250 个菌。关键词: 美国红鱼海豚链球菌鉴定致病性检测2 A b str a e tR e dd r u m ( S ciG en o p so cetla tu s), am e m b e r o f th ef a m ily S cia e n id a e , o r ig in a te df r o mn o r th e mc o a st o fA tla n tic a n d th eg u lfo fM ex ico . It b e c a m e o n e o fth e m o stp o p u la r sp e c ie so fm a r in e c u ltu r e w o r d w id eo w in gto its d elicio u sta ste , r a p id g r o w tha n d g o o d a d a p ta tio nto th e e n v ir o n m e n t. It w a s in tr o d u c e d in 19 9 1a n d w a sp r o p a g a te dsu ccessf u llyin19 9 5. N o wit w a sw id e lycu ltu r e dinp o n d sa n dc a g e sinth e co a sta i a r e a s. T h e o c c u r e n c eo f R e dd r u md isea sein cr e a se dc o m p a n ie db yla r g ersc a le o f f ishcu ltu r e a n din ten siv ef ish cu ltu re.F r o mth e la st h a lf o f 2 0 0 0 to D e c e m b e r 20 01, th e ca g ecu ltu r edr e dd r u m inZ h o u sh a nZ h ejia n gP r o v in c e , e x p e r ie n c e dac o n tin u o u s m o r ta lity . In f ectedr e dd r u mp r e se n te de x te r n a l sig n s, su c ha se x o p h th a im ia , e y e o p a city , sk inle sio n e tc . T h estr a in s S O 一2 a n d S O . , 3 w e r e iso la ted f r o m th ek id n e yo fm o r ib u n d r e d d r u m . T h e yw e r e id en tif iedb y m o r p h o lo g ic a l o bserva tio n, 曲ysio ch em ica ltest a n d 16 S r R N Ag e n eP C R . T h e se t w o iso la te sp r e se n te dty p ica lch a ra cteristics o fS tr e p to c o c c u sin ia ew ithg ram - positivec o c c i in ch a in s, ca ta la se n e g a tiv ea n db e ta h e m o ly tic , g r o w thu n d er10 ℃a n dn o n - g ro w th u p 4 5℃ , h y d r o ly z a tio no f e sc u lin a n da r g in in e,V o g e sP r o sk a u e gu r e a se , a n dh ip p u r a tetestsn e g a tiv e , f e r m e n ta tio no fg lu co se, sa licin ,su c r o sea n dsta r ch , n o n . f er m en ta tio no fa ra bin o se, in u lin ,la cto se, m elibio se, ra f f m o sea n dso rb it0 1. D ef in itiv e id en tif ica tio n o f th e iso la tes w a sf iv th erso u g h t b yp o ly m er a sec h a in r ea ctio n o fa3 0 0 b plo n gse q u e n c einth e16 S r R N Au sin gp r im e r s sp ecif icf o rX in ia e . T h e se tw ostra in s w e r e id en tif ied a s S tr e p to c o c c u sin ia e f u r th erc o m p a r e dw ithB e r g e y "sM a n u a lo J、 S y stem ic B a c te r io lo g ya n dr e p o r te d sy m p to m so fS . in ia ein f ectedfish.T h ep a th o g e n icityo f th e se t w oiso la tes to r e dd r u m , tila p iaa n dm o u sew a ste ste dT h e L D 50 o f S O 一2 a n d S O 一3 to r e d d r u m w e r e 4 . 8 × 10 8 C F U /f ish a n d 1, 9×10 7 C F U /f ish . totila p ia2. 8 × 10 8 C F U /f ish a n d 8 . 3× 10 7 C F U /f ish , to m o u se 9. 6×10 6 C F U /m o u se a n d 4 . 2 X10 6 C F U /m o u se . r e sp e c tiv e ly . T h ein f e c te d f ish p r e se n te dth e sim ila r ex ter n a l sig n sto n a tu r a l in f ected r e d d r u m , su cha se x o p h th a lm ia ,e y e o p a c itya n dd iso r ien ta tio n . T h eto x icityo fS O 一2 a n dS O 一3 to m o u sew e r e 50 a n d4. 5tim e s a s to r e dd r u m , a n d 29. 2a n d 19. 8 tim e sa stotila p ia , resp ectiv ely . Itin d ica te dth in th ese tw ostra in s w e r em o r ep a th o g e n itictom a m m a ls, w h ic hw a sc o in c id e n t w ithth ec o n c lu sio nth a tSin ia e W a Sp a th o g e n ictOm o u sea n dc o u ldc a u s ein v a siv e d ise a sein h u m a n s. S . in ia e n o to n lyd oh a r mto th ef ish er yb u t a lsoth r e a te n toth e f o o dsa f e tya n dh u m a nh ea lth .T h esen sitiv ityto a n tib io tics o fS O 一2 a n dS O 一3 w e r ete ste d . T h e resu lt sh o w e dth a tth e yw e r eh ig h lysen sitiv e toa m p ic ilin , v a n c o m y c ina n dc e p h a le x in V , w h ileresista n ttog e n ta m ic in , c o m p o u n dsu lf a m e th o x a z o le , lin c o m y c ina n dn o rf lo x a cin ,T h em e th o d o fd etectin gS . in ia e w a Sp r im a r ilye sta b lish e d . T h ese r tlma n da sciteso f S in ia ea n tib o d yw e r ep r e p a r e d . T h e a n tibo d y titres o fse r u ma n d a scites w e r e1: 16~1: 256a n d 1: 8~l: 64b yu sin gm ic r o p la te a g g u la tin a tio n . 1: 6 4 0 0a n d1: 320 0b yin d irectE L IS A , a n dth e tw o stra in s b e lo n g e dtO th e sa m ese r o ty p e . T h em in im u ma m o u n to f b a c te r iaw h ic hc o u ldb ed e te c te dw a s 1250b yD o t- E L IS A .K e yw o r d s: R e dd r u m ; S tr e p to c o c c u sin ia e; Id en tif ica tio n ; P a th o g en icity ; D etect4 文献综述第一部分链球菌概述链球菌( S trep to co ccu s)广泛分布于自然界的水体、 尘埃中, 人和动物体表、机体中, 有些构成人和动物的正常菌群, 有些是非致病菌, 有些是致病菌, 能引起人类猩红热、 丹毒、 脑膜炎、 蜂窝组织炎以及链球菌变态反应性疾病等, 马、牛、 猪、 鸡等畜禽的各种化脓性炎症、 败血症等, 鱼类的脑膜( 脑)炎等, 导致动物严重死亡, 危害人类健康。1分类地位链球菌为兼性厌氧的革兰氏阳性球菌( G P C )。 19 9 4 年第九版《伯杰氏细菌鉴定手册》 中兼性厌氧的G P C 有13个属。 链球菌属是一个具有悠久历史的属, 但它的分类地位并不稳定。 19 7 4 年版的《伯杰氏系统细菌学手册》 中链球菌属与气球菌属、 明串球菌属、 片球菌属和孪生球菌属共问组成链球菌科。 由于16S rR N A序列同源性的应用, 根据遗传特性和生化特性, 19 8 6 年版《伯杰氏系统细菌学手册》 将肠球菌属和乳球菌属从链球菌属独立出来, 原来的肠球菌群即兰氏血清群D 另立为肠球菌属E 刀teT O C O C C U S , 乳酸链球菌群成为新属乳球菌属L scto co ccu s,而链球菌科也被取消, 链球菌属成为革兰氏阳性球菌中一个位置不定的属“。 。 “。2分类19 0 3年, S h o ttm u ller 最早尝试区分链球菌, 他利用血琼脂区分出B 溶血的菌株。 1933年, L a n cef ield 报道了与B 溶血菌株相关的特异性的碳水化合物“群”抗原检测技术。 19 37 年, S h er m a n 提出根据溶血反应、 群碳水化合物抗原和表现型测试( 主要是发酵和耐受性测试)将链球菌划分为四大类, 这四大类是化脓类( p y o g e n ic d iv isio n )、 草绿色类( v irid a n sd iv isio n )、 乳类( 1a ctic d iv isio n )和肠球菌类( en tero co ccid iv isio n )。 化脓类包括具有群抗原A 、 B 、 C 、 E 、 F 和G 的目溶血菌株。 草绿色类链球菌包括那些非B 溶血的、 不耐高p H 、 不耐盐以及在IO 。 C 不生长的种类。 乳类链球菌包括那些主要与乳制品生产有关的菌株: 非 B 溶血、 IO T 生长、 4 5。 C 不长、 在含6. 5%N a C l的肉汤中不长。 肠球菌类耐高p H 、高盐浓度以及在lOO C g a45。 C 均能生长的特点, 使之区别于另三类。 ” 。表i链球菌S h e r m a n 氏分类化脓类草绿色类乳类肠球菌类B 溶血p H 9 . 6+6 . 5%N a C l+lO ℃生长4 5℃生长★大部分肠球菌非B 溶血。链球菌的分类和鉴定由于依据其复杂特性中非常有限的几个特性而受到限制。 八十年代中期以来, D N A D N A 杂交、 16 S r R N A 基因测序、 全细胞蛋白分析、多位点酶电泳等分子技术应用于链球菌属和种的鉴定中, 使链球菌属的分类和命名法发生了巨大的变化。 目前链球菌属的分类最常用的主要有三套系统, 即: 种名分类系统、 兰氏分群系统和溶血性分类系统“ 6。 “。2. 1种名分类系统与其它细菌共有的一个分类系统。 主要根据细菌的形态、 生理生化特性和16 S r R N A 序列分析等进行种的鉴定, 是最正式的分类系统, 也是最常用的分类系统。 目前链球菌属共有50 多种, 比较常见的有10 多种。2. 2兰氏分群系统19 33年由L a n cef ield 建立。 该分类系统是根据链球菌细胞壁中的多糖成分又称c抗原的差异将链球菌分成不同的血清群。 其抗原决定簇为肽聚糖中的氨基多糖。 兰氏分类即以氨基糖类为基础, 目前已确定A 、 B 、 c、 D v 等20 个血清型( 其中I和J缺), 有的分离株尚不能定型。 对人致病的9 0 %属于A 群, 其次为B 群, 其它少见, A 群又称为化脓性链球菌( P y o g e n ic str e p to C O C C H S )。2. 3溶血性分类系统根据链球菌对红细胞的溶血能力分为n 、 B 和Y 三类, 在鉴定链球菌的致病性方面有一定的意义。2. 3. id 型溶血链球菌( Ⅱ 一h em o ly tic str e p Z O C O c c u s)6 在菌落周围形成狭窄的草绿色溶血环, 环内红细胞未溶解, 血红蛋白变成绿色, 这类链球菌亦称为草绿色链球菌( S tr ep to co ccu s v ir id a n s)。 此类细菌致病力不强, 多为条件致病菌。 在人类呼吸道及肠道中有a 型溶血链球菌正常寄生,但有时也可引起亚急性心内膜炎等症。2. 3. 2 B 型溶血链球菌( ¥ h e m o ly tic stre叶o co ccu s)在菌落周围形成较宽的透明的溶血环, 环内红细胞完全溶解; 有时在培养基表面生长的菌落不溶血, 在深部生长者则溶血明显, 这是该菌产生的0 溶血素遇氧失活所致。 这类链球菌又称为溶血性链球菌( S trep to co ccu s h em o ly tics), 致病力强, 常引起人及动物各种疾病。2. 3. 3 Y 型溶血链球菌( Y str ep to co ccu s)此类链球菌不产生溶血素, 菌落周围无溶血环, 故又称为非溶血性链球菌( S tr e p to c o c c u s n o n h em o ly tics), 一般无致病力, 常存在于乳类和粪便中。3基本特性3. 1形态与染色链球菌呈球形或卵圆形, 直径0 . 5~2. 0um , 呈链状排列, 短者4 ~8 个细菌组成, 长者有20 ~30 个细菌组成, 液体培养对数生长期的链球菌常呈长链排列。 革兰氏阳性, 老龄的培养物或被吞噬细胞吞噬的细菌呈现阴性。 A 、 B 、 C 群等多数幼龄培养物可见到透明质酸形成的荚膜。 无芽孢。 除个别D 群菌外, 均无鞭毛。 A 群等的一些菌株有菌毛。 不运动。 1。3. 2培养特性需氧或兼性厌氧, 有些为厌氧菌。 营养要求较高。 普通培养基中生长不良,需加有血液、 血清、 葡萄糖等。 生长温度范围通常为25~4 5"C , 最适温度37 。 C ,最适p H 7 . 4 ~7 . 6, 血琼脂平板上形成直径0 . 1~1. 0 m m , 灰白、 光滑、 园形突起小菌落, 不同菌株在菌落周围出现不同溶血环。 液体培养基中生长, 初呈均匀混浊, 后因细菌形成长链而呈颗粒状沉淀管底, 上清透明“。 73。3. 3抵抗力链球菌抵抗力不强, 60 。 C 30 m in 即被杀死, 对一般消毒剂敏感。 溶血性链球菌对青霉素、 红霉素、 氯霉素、 四环素和磺胺类等抗菌药物敏感, 很少有耐药株发生” 。 4 致病因子致病性链球菌可产生各种毒性物质, 从而达到侵害宿主细胞, 发挥致病作用的目的。 几种主要的致病因子如下” ll- l!]4 . 1微荚膜大多数链球菌在幼龄培养物中可见到由透明质酸形成的微荚膜, 微荚膜具有抗吞噬作用, 有利于细菌侵袭宿主后迅速繁殖而致病。4. 2 M 蛋白是A 群链球菌细胞壁中的蛋白组分。 M 蛋白能穿过荚膜延伸至菌体表面成为菌毛。 M 蛋白具有抗吞噬和抵抗吞噬细胞内的杀菌作用, 增强细菌的侵袭力。 纯化的M 蛋白能使纤维蛋白原沉淀、 凝聚血小板和白细胞、 溶解中性粒细胞, 并抑制毛细血管内白细胞的移动。 M 蛋白是链球菌重要的表面抗原, 刺激机体产生型特异性抗体。4 . 3脂磷壁酸( u A )与细菌粘附于宿主细胞表面有关, 大多数L T A 位于细胞膜和肽聚糖之间, 通过肽聚糖孔伸展至细菌细胞表面。 致病性链球菌细胞壁上的L T A 与动物皮肤及粘膜表面等的细胞具有高度亲和力, 使菌体易于吸附于宿主细胞表面。4 . 4 透明质酸酶( h y a lu ro n id a se)又称为扩散因子, 可溶解细胞间质的透明质酸, 使细菌易于在组织中扩散,从而加强细菌的致病力。4. 5链激酶( S trep to k in a se, S K )又称链球菌溶纤维蛋自酶( S tr ep to co cca l f ib r in o ly sin ), 是一种激酶, 能激活血液中的血浆蛋白酶原, 成为血浆蛋白酶, 即可溶解血块或阻止血浆凝固,有助于细菌在组织中扩散。 该酶耐热, 加热10 0 。 C , 50 分钟仍保持活性。 链激酶抗体能中和该酶的活性。4 . 6链道酶( S trep to d o n a se)又名链球菌脱氧核糖核酸酶( S trep to co cca l d eo x y ribo n u clea se), 主要由A 、 c、G 群链球菌产生。 此酶能分解粘稠脓液中具有高度粘性的D N A , 使脓汁稀薄易于扩散。 产生的相应抗体能中和该酶的活性。4 . 7 链球菌溶细胞素( C y to ly sin ) 链球菌溶细胞素是一类外毒素, 由溶血性链球菌产生, 有溶解红细胞, 杀死白细胞及毒害心脏的作用, 主要有A 、 C 和G 群等链球菌产生的链球菌溶血素( S tr ep to ty sin )“0 ” 和“s” 两种, 另外还有B 群链球菌产生的B 一溶血素( 13一h ...

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